館内には多彩な姫路市立水族館の見どころが凝縮されています。なかでも来館者が真っ先に驚くのが、新館と本館を結ぶ連絡通路にあたる手柄山交流ステーションです。
ここには、かつて姫路駅から手柄山を結んでいた「姫路モノレール」の実物車両が当時のプラットホームとともにそのまま保存されており、姫路市立水族館のモノレール展示室として誰でも自由に見学できます。昭和レトロな近未来デザインの車体内部に入ることもでき、鉄道遺産としての価値も極めて高いスポットです。
生き物展示のハイライトは、屋外に設けられたウミガメプールと屋内のタッチプールです。ウミガメが悠然と泳ぐ姿を上部デッキと水中窓の双方から観察できるほか、時間帯によっては大迫力の給餌シーンを間近で体感できます。
さらに「じゃぶじゃぶ小川」やタッチプールでは、ヒトデやナマコ、ドクターフィッシュ（ガラ・ルファ）などに直接触れる体験が可能で、子どもたちが夢中になって水生生物と触れ合う姿が印象的です。播磨に生息する特別天然記念物「オオサンショウウオ」のじっくり観察できる大型水槽も必見の展示となっています。
